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第一部分 MicroRNA及其靶标的鉴定1

1.病毒microRNA的鉴定3

1.引言3

2.病毒microRNA候选分子的计算机预测7

2.1计算机鉴定microRNA的原理7

2.2运用VMir预测病毒microRNA候选分子9

3.病毒microRNA候选分子的芯片验证11

3.1芯片的设计13

3.2芯片的杂交15

3.2.1小RNA的胶纯化16

3.2.2标记和芯片的杂交18

3.3数据分析19

4.结束语21

参考文献22

2.应用鲁棒性机器学习算法预测microRNA基因及其靶标25

1.引言26

2.正确的使用机器语言27

2.1数据集28

2.2性能估算28

2.3性能测量30

2.4机器学习步骤31

3.一种确定性和一种随机性的算法33

3.1支持向量机33

3.2Boosted遗传规划35

4.使用支持向量机预测microRNA基因37

4.1决定输入38

4.2收集训练集39

4.3MicroRNA基因预测软件的训练及其性能估计39

4.4评估microRNA基因预测软件的性能42

5.使用强化遗传算法预测microRNA靶标43

5.1决定输入43

5.2装配训练集44

5.3训练和评估microRNA靶基因预测软件44

5.4评估microRNA靶基因预测软件45

6.小结46

致谢46

参考文献46

3.病毒编码microRNA的鉴定51

1.引言52

2.Rn12（1-249）和腺苷酸化的3′接头寡核苷酸的纯化55

3.小RNA片段的分离55

4.纯化小RNA与腺苷酸化3′接头的连接56

5.小RNA-3′接头与5′接头的连接56

6.连接产物的逆转录反应57

7.cDNA的首次PCR扩增57

8.PmeⅠ酶切PCR产物58

9.二次PCR扩增58

10.BanⅠ酶切二次PCR产物59

11.BanⅠ酶切DNA的串联连接59

12.串联体的末端加尾与克隆入T／A载体59

13.文库的测序及注释60

14.结束语60

参考文献61

4.MicroRNA靶标预测的计算机方法65

1.引言66

2.microRNA靶标识别的原理69

3.microRNA靶标基因分析的数据源73

4.microRNA靶标预测的计算机软件74

5.microRNA靶标基因预测的原始策略79

6.计算机预测的验证81

7.结束语82

致谢83

参考文献83

第二部 MicroRNA的表达、成熟与功能分析87

5.Dorsha复合体活性的体外和体内检测89

1.引言89

2.实验方法94

2.1体外分析pri-miRNA的加工94

2.1.1制备放射性标记的pri-miRNA转录本94

2.1.2制备microprocessor96

2.1.3Pri-microRNA加工的体外实验分析97

2.2体内分析pri-miRNA的加工99

2.2.1果蝇的Drosha或DGCR8的缺失100

2.2.2Pri-miRNA的RT-PCR分析100

2.2.3Northern杂交分析microRNA101

致谢105

参考文献105

6.MicroRNA基因表达的基因芯片分析107

1.引言107

2.microRNA生物合成与作用方式的概述109

3.microRNA表达的分析策略110

4.microRNA基因芯片分析的注意事项111

5.数据分析与说明112

6.验证策略113

7.microRNA基因芯片实验方案113

7.1芯片点阵113

7.2RNA提取114

7.3标记和清洗114

7.4杂交115

8.数据分析118

致谢119

参考文献119

7.哺乳动物细胞microRNA的克隆与表达检测123

1.引言124

2.microRNA的克隆126

2.1总RNA提取126

2.2运用flashPAGETM分离体系分离小RNA128

2.3小RNA的多聚腺苷酸化129

2.4多聚腺苷化小RNA的5′末端接头连接130

2.5反转录130

2.6PCR扩增第一条cDNA链131

2.7聚丙烯酰胺凝胶纯化扩增的cDNA131

2.8PCR产物克隆到TOPO-TA载体133

3.microRNA的鉴定133

4.Northern杂交验证microRNA的体内表达134

致谢136

参考文献136

8.体外与体内研究microRNA和小干扰RNA甲基化的方法139

1.引言140

2.重组HEN1蛋白的表达与纯化141

2.1构建表达载体141

2.2带GST标签的hen1蛋白的表达和纯化142

2.3带His标签的hen1蛋白的表达和制备143

3.利用重组HEN1蛋白对小RNA甲基转移酶的检测144

3.1通过监测掺入的［14碳］-甲基基团进行甲基转移酶分析144

3.2通过监测掺入的［3氢］-甲基基团进行甲基转移酶分析145

3.3通过监测β-消除进行甲基转移酶分析147

4.应用逆相HPLC确定HEN1-催化反应产物中甲基基团的位置148

5.免疫沉淀与HEN1活力检测149

5.135S：：HA-HEN1的构建和植物转化149

5.2HA-HEN1免疫沉淀和酶活性分析149

6.microRNA和siRNA体内甲基化状态的分析151

7.结束语152

致谢152

参考文献153

9.发育过程中小RNA表达谱的分析155

1.引言156

2.低分子量RNA的制备与尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea-PAGE）158

2.1原理158

2.2方法158

2.3材料159

2.4备注160

3.小RNA的克隆161

3.1原理161

3.2方法161

3.3材料162

3.4备注163

4.小RNA的分类163

4.1方法163

5.Northern杂交分析165

5.1原理165

5.2方法166

5.3材料167

5.4备注167

参考文献167

10.T细胞发育过程中microRNA介导的基因调控与功能171

1.引言172

2.T细胞发育过程中microRNA表达特征的分析172

2.1MicroRNA克隆分析174

2.2MicroRNA定量PCR分析175

3.构建表达microRNA的逆转录病毒载体178

4.T细胞发育过程中microRNA的功能研究180

5.功能相关microRNA靶标基因的鉴定和验证183

6.材料与试剂187

致谢188

参考文献188

第三部分 MicroRNA与疾病191

11.白血病与淋巴瘤microRNA表达异常的研究193

1.各种人类癌症的起始和发展都涉及microRNA表达的改变194

2.基因组范围microRNA表达谱的基因芯片检测195

2.1样品收集200

2.2总RNA分离200

2.3MicroRNA芯片的生产和描述201

2.4靶标准备202

2.5芯片杂交202

2.6原始数据分析203

2.7验证microRNA的结果204

3.差异表达microRNA靶标的鉴定和验证205

3.1构建有重要生物学意义的可能性靶标的数据库206

3.2序列互补性研究207

3.3荧光素酶活性报告分析208

3.4相关病例中microRNA与mRNA靶标表达的相关性208

3.5在体内鉴定差异表达microRNA的作用209

致谢210

参考文献210

12.植物中受病原调控的小RNA的发现215

1.引言216

2.基于测序方法发现受病原调控的小RNA217

3.基于杂交方法鉴定和验证受病原诱导的小RNA219

3.1病原体感染组织的小RNA提取219

3.1.GITC法提取总RNA220

3.2小分子RNA的电泳和凝胶转移221

3.3小RNA的杂交和检测222

3.3.1使用末端标记的寡核苷酸探针检测小RNA222

3.3.2使用一种核糖核酸探针检测小RNA224

4.结束语225

参考文献226

13.病毒microRNA表达与功能分析的实验方案229

1.引言230

2.microRNA的表达框232

3.稳定导入的载体系统233

4.实验步骤：利用pNL-SIN-CMV-BLR microRNA表达载体构建表达microRNA的细胞系235

5.根据报告基因确定microRNA的活性237

6.实验步骤：病毒混合物制备与报告基因检测237

7.结束语240

致谢240

参考文献240

作者索引245

主题索引257